Ensayo de luciferasa: Tipos, mecanismos y usos.

La luciérnaga presenta la enzima utilizada en el ensayo de luciferasa. Terry priest (licencia).

Introducción al ensayo de luciferasa.

El ensayo de luciferasa es una herramienta comúnmente usada para el estudio de expresión génica a nivel transcripcional. Su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo, alta sensibilidad entre otras cosas son las características que hacen de esta herramienta una de las preferidas para estudiar mutaciones, particularmente deleciones.

Este ensayo se logra gracias a reacciones que permiten generación de luz que se mide con un luminómetro. Las enzimas luciferasa son un conjunto de enzimas oxidativas que median estas reacciones. Son encontradas en varias especies, permitiendo a estos organismos expresar bioluminiscencia, es decir, les permite emitir luz. Entre estas especies encontramos a la renilla reniformis o pensamiento de mar, los copépodos y, la más común, la luciérnaga.

Mecanismos.

Single-luciferase reporter assay system: Entre los pasos tenemos primeramente la identificación del factor promotor del gen de interés, posteriormente lo clonaremos rio arriba del gen de la luciferasa. Serán agregados a un plásmido que ingresará a la célula a través de transfección o transformación. Ya en la célula el gen de la luciferasa se transcribirá proporcionalmente a cómo lo haría el gen de interés, pues comparten los requerimientos para su transcripción gracias al factor promotor. Este ARN mensajero se traducirá normalmente en un ribosoma dando la enzima reportera luciferasa. Luego se cultivarán las células y se someterán a una sustancia que provocará la lisis celular, dejando la luciferasa libre. La luciferasa catalizará la reacción de la luciferina y ATP (estos sustratos podrían venir en conjunto con la sustancia que provoca la lisis celular) formando AMP, oxiluciferina y luz. Finalmente la cantidad de luz se puede cuantificar con un luminómetro.

Dual-luciferase reporter assay system: La gran diferencia con el anterior es que utiliza otro plásmido más, será un plásmido con un gen luciferasa distinto al previamente usado (si el anterior es de luciérnaga, este podría ser de renilla), será unido río arriba con un factor promotor constitutivo, que estará siempre expresándose manteniendo el nivel. Nos servirá como control.

También podrían los dos plásmidos tener distintas regiones promotoras de distintos genes de interés. De hecho, técnicamente podrían ser más que dos. Sin embargo lo más común es usar el segundo plásmido como control.

Imagen por TransControl (en.wikipedia)

In vivo: Anteriormente hemos mencionado que se debe cometer lisis de la célula para liberar la luciferasa, sin embargo, también es cierto que se puede hacer ensayos de luciferasa sin destruir la célula. Esto se hace gracias a que existen organismos que secretan la luciferasa, como por ejemplo los copépodos. Copiando este gen, anclándolo a la región promotora del gen de interés y luego incluyéndolo en el plásmido será suficiente para que ahora la luciferasa sea secretada por la célula. Solo haría falta agregar los sustratos para obtener la bioluminiscencia que podría ser medida.

Usos.

Se utiliza para ver el efecto de mutaciones, deleciones, etc. Un análisis muy común para el cual se utiliza el ensayo de luciferasa es el análisis de deleción.

Análisis de deleción: Es un análisis en el que se cortan pares de bases río arriba sistemáticamente de un gen de interés. La transcripción del gen puede ser medida mediante el ensayo de luciferasa. De esta manera, cortamos el factor promotor clonado del gen de interés. Naturalmente cuando la expresión de la luciferasa se ve disminuida, si hemos seguido los pasos correctamente, podemos inferir que hemos encontrado una secuencia de control.

Ejemplo: El factor VIII es una glicoproteína que es esencial para la coagulación sanguínea. Usando un análisis de deleción, los investigadores, al ver la actividad de la luciferasa, concluyeron que una región promotora de cerca de 200 pares de bases contenían los elementos necesarios para una adecuada expresión del factor VIII.

Entre las ventajas de este tipo de ensayo podemos nombrar:

-Rápido, fácil, simple.

-Relativo bajo costo.

-Medición cuantitativa de buena precisión.

-No se encuentra en células normales.

-Alta sensibilidad

ž Este ensayo esta disponible en el mercado de 4 formas principalmente:

ž Luciferase assay kit (800 assays/kit)

ž Luciferase assay kit (1600 assays)

ž Luciferase assay kit (3200 assays)

ž Luciferase assay kit HTS (4800 assays/kit)

Bibliografía: